本标准规定了甘薯种薯及种苗的繁育规程，适用于河南省各甘薯种薯（苗）产地及栽培区。

2脱毒种薯（苗）的分级标准

2.1 高级脱毒试管苗

即经过严格病毒检测确认不含有已知病毒或指定病毒，且经过株系评选而中选的优良试管苗以及用它离体快繁或防蚜虫条件下速繁后得到的甘薯试管苗。

2.2原原种

即在防蚜虫网棚内无病原土壤上栽种高级脱毒试管苗生产的种薯。用原原种种薯在防蚜虫条件下育出的薯苗叫原原种苗。

2.3原种

即利用原原种苗在具备500m以上隔离条件（即500m 内没有种植普通带毒甘薯）而且土壤无病原的田块生产的种薯。由原种在防蚜虫条件下育出的薯苗叫原种苗。

2.4良种

即利用原种苗在普通无病留种田块生产的种薯。良种育出的苗叫良种苗。

脱毒甘薯种薯分级指标

注：1.病毒检测方法及标准参见甘薯脱毒苗病毒检测方法及标准。

2.薯块分级（纯度、整齐度、不完整薯块）按GB4406-84标准确定。薯块整齐度是指重100～250g的薯块占总量的百分比；不完整薯块系指机械损伤、虫鼠咬伤、自然干裂或严重畸形的薯块所占总块数的百分比。

3脱毒甘薯种薯（苗）生产技术与标准

3.1高级脱毒试管苗生产

3.1.1脱毒茎尖苗培育

选具有本品种特征特性的无病甘薯苗茎顶部3cm长的芽段，用70%酒精、3%漂白粉液分别消毒，在超净工作台内解剖镜下剥离茎尖。将剥离的长约0.2～0.5mm（一般带1～2个叶原基）的茎尖接种在附加1～2mg/l 6-BA的MS培养基上，26～28℃下光培养，茎尖膨大变绿后转入无激素的MS培养基上培养成茎尖试管苗。待苗长至5～6片叶时移至营养钵内进行病毒检测。

脱毒茎尖苗是指茎尖分生组织培养得到的不含有已知病毒或指定病毒的茎尖苗。必须经过本规程中有关方法及程序进行病毒检测，从中筛选出脱毒茎尖苗。

3.1.2高级脱毒试管苗繁育

经病毒检测确认的脱毒苗必须进行优良株系评选，淘汰变异株系，保留优良株系。株系评选的方法是：将脱毒苗株系切段快繁成10株以上，每系取5～10株栽种到防虫网室内，以同品种普通带毒薯为对照，进行形态、长势、产量等多方面的观察评定，选出若干既符合品种特性又高产的最优株系，混合繁殖成原原种。与最优株系相同来源的脱毒试管苗混合快繁，即为高级脱毒试管苗。

高级脱毒试管苗离体切段快繁：将待繁的高级脱毒试管苗在无菌条件下切成一叶一节的切段，扦插在无激素的MS培养基上，在26～28℃， 14～16h光照条件下离体培养，25～30d左右即可长成5～7片叶大小的幼苗，可以进入下一轮切段快繁。

3.2原原种繁育

脱毒甘薯原原种的繁育必须具备3方面的条件。第一，栽种的苗必须是高级脱毒试管苗。第二，必须要在防虫网棚内生产原原种。防虫网棚是繁育原原种的重要条件之一，而且所用防虫网的网眼必须在40目以上，这样蚜虫就不能通过，可以大大减少蚜虫传播病毒的机会。第三，所用地块必须是无病原土壤，最好选用多年未栽种过甘薯的土壤。

在繁殖原原种时，要始终贯穿防止病毒再侵染的意识。在网棚内每隔5～10米种植一些指示植物，每隔15天喷洒一次杀虫药剂，防治蚜虫，以防蚜虫传毒。防蚜虫时最好多种药剂轮换使用，以免蚜虫产生抗药性，达不到防治效果。

原原种生产过程中要定期逐株观察是否有病毒症状，一旦发现病株要坚决拔除。如果网棚内所种植的指示植物表现病毒症状，整个棚内所繁殖的种薯应降级使用。

3.3原种繁育

原种的繁殖必须具备（1）所用薯苗为原原种苗；（2）具有500m内无普通带毒甘薯种植的空间隔离条件；（3）所用田块至少3年以上没种过普通带毒甘薯，且为无茎线虫病、根腐病、黑斑病等的无病田。

原种繁殖时要密切注意防止病毒再侵染。要在繁殖田内每隔15～20米种植一些指示植物，每15d定期喷洒防蚜虫药剂，以防蚜虫传毒。收获前要观察病毒发病情况，及时拔去病株。收获时严把质量关，不符合质量要求的薯块坚决不入窖。

3.4良种繁育

良种繁育必须具备条件：（1）必须用原种苗进行繁育；（2）所用田块应为无病留种田，无茎线虫病、根腐病、黑斑病等。

各级种薯生产的要求和主要措施

4脱毒苗的病毒检测方法与标准

4.1脱毒苗的病毒检测方法

4.1.1目测法

目测法是根据甘薯叶片和薯块上出现的典型症状判断甘薯是否感染病毒。甘薯病毒病的症状主要包括：（1）叶斑型。主要有紫色羽状斑、紫斑、紫环斑、黄色斑或者枯斑（2）花叶型。苗期感病后，初期叶脉呈网状透明，后沿叶脉出现不规则黄绿相间的花叶斑纹（3）卷叶型。叶片边缘上卷，严重者可形成杯状（4）叶片皱缩型。病苗叶片较小，皱缩，叶缘不整齐，甚至扭曲畸形（5）叶片黄化型。包括叶片黄化及网状黄脉。薯块上的症状主要是产生黑褐色或黄褐色龟裂纹。

病毒病的症状可因病毒种类、甘薯品种以及环境条件等因素的影响而改变，因此根据症状只能作初步判断。另外，目测法还应注意区分甘薯品种特性以及由于土壤水份对大、营养失调等原因造成的生理病害与病毒病症状的差异。

4.1.2指示植物法

常用巴西牵牛(Ipomoea setosa)作指示植物，几乎所有侵染甘薯的病毒都能感染巴西牵牛，因此，将薯苗嫁接在巴西牵牛上，从巴西牵牛的显症情况可判断薯苗是否带毒。具体嫁接方法如下：以薯苗芽尖作接穗，将芽尖削成楔形，另将具3-4片真叶的巴西牵牛作砧木，在其茎中部切一斜口把楔形接穗插入，用封口膜扎住，置防虫网室内遮阴保湿3-4天，然后在自然光照下观察记载牵牛的显症情况，一般嫁接后25～30天左右开始出现症状,显症初期新生叶出现系统性明脉，以后发展为花叶或皱缩等症状。

4.1.3甘薯病毒的血清学检测

常用的血清学检测方法为酶联免疫吸附法（ELISA）或在此基础上改进的斑点酶联免疫吸附法（Dot-Blot ELISA）等。Dot-Blot ELISA具有快速和能检测大量样品的特点，在大量检测样品时较常应用。具体检测方法如下：

(1)样品处理：取直径约为1cm的样品叶片（约0.1g），加入1ml抽提缓冲液，迅速研磨，置小离心管中，取上清液供检测用。

(2)点样：将NC膜在TBS(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, )中充分湿润，然后放在一张干燥滤纸上，让其稍事干燥，用铅笔作好记号，用微量取样器进行点样，点样后让NC膜自然干燥。

(3)反应:

（a）封闭: 将点样后的NC膜转入封闭液(TBST+5%脱脂奶粉)中封闭1小时或4℃封闭过夜。

(b) 第一抗体反应: 封闭后的NC膜用TBST(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20)漂洗2-3次, 每次5-10分钟, 加入用TBST稀释的病毒专化抗血清(1:2000) 37℃保温1小时, 再用TBST洗膜3次, 每次5-10分钟。

(c) 第二抗体反应: 加入TBST稀释的碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG(1:5000), 37℃保温1小时, 再用TBST洗膜3次, 每次5-10分钟。

(d) 显色: 避光条件下, 将NC膜置于含330μg/ml NBT和165μg/ml BCIP的碱性磷酸酯酶缓冲液(100mM Tris-HCl, pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCL₂)中显色至样点清晰, 将膜放入蒸馏水中漂洗, 终止显色反应。取出晾干, 拍照。

4.1.4分子生物学方法检测

近年来，随着分子病毒学的发展，一些甘薯病毒（例如SPFMV、SPLV等）的核苷酸序列已经清楚，根据已知的核酸序列，设计特异引物，利用RT-PCR可快速检测甘薯病毒和病毒的不同株系。也可利用核酸探针，通过核酸杂交的方法检测病毒的存在。

4.2 不同级别脱毒苗的检测

由于甘薯脱毒苗在繁育过程中极易受到病毒的再侵染，因此，在繁种过程中，除根据不同级别种薯的繁种要求采取防治蚜虫等必要措施外，还应加强病毒的检测，及时淘汰感病种薯以保证脱毒种薯的质量。根据不同级别种薯对病毒感染率的要求，可采取不同的病毒检测方法。

4.2.1 茎尖苗的检测

茎尖苗的检测可首先采取目测法。由于脱毒茎尖苗和带毒茎尖苗在形态、长势上有明显差异，前者生长快、叶片平展、植株较健壮；后者长势弱，叶片上常出现花叶、明脉和褪绿斑等症状，因此，可先用目测法淘汰弱苗和显症苗。然后再用血清学方法或分子生物学方法进行筛选，经血清学或分子生物学方法检测呈阴性的样品再进行嫁接。每个茎尖苗一般嫁接3-5株，有1株发病即认为该样带毒，对于都不发病的样品应再重复嫁接1次。

4.2.2 原原种田的检测

脱毒原原种的繁殖一般在防虫网室内进行，原原种田病毒的检测方法是：首先在原原种田种植若干株巴西牵牛，定期观察巴西牵牛是否显症、以判断是否有蚜虫传毒；对原原种田还要进行定期普查，及时淘汰显症株和变异株；另外对原原种田要定期取样，用血清学方法或嫁接指示植物的方法进行检测，以判断原原种田病毒的感染情况，对于病毒感染率超标的繁种田要降级使用。

4.2.3 原种田的检测

脱毒原种的繁殖要在有一定隔离区的地方进行，即周围500米内不能种植非脱毒薯。原种田的病毒检测以目测法和田间种植巴西牵牛为主，必要时田间取样用血清学方法检测病毒的感染率。

4.2.4 良种田的检测

良种田的病毒检测以目测法为主，就是要定期对良种田的发病率进行调查，必要时也可抽样用血清学方法检测，当发病率超过一定标准时就不能再作为种薯使用。

4.2.5不同级别脱毒苗的质量标准

根据不同级别脱毒苗对病毒感染率的不同要求，初步制定以下判断标准，病毒感染率超过一定标准的应降级使用。

甘薯脱毒苗病毒检测方法及标准（试行）

5脱毒甘薯繁育供种体系

脱毒甘薯的繁育体系是指经省（市、区、县）有关部门核准，由不同单位组成的完成的脱毒甘薯、马铃薯种薯及种苗生产的各层次、各环节任务的组织整体。

良种利用2年后增产效果就不再明显，需要每2年更换一次新脱毒薯种。因此，必须根据当地生产和经济条件，建立起脱毒甘薯繁育与供应体系，以源源不断地为生产提供优良脱毒薯种，确保脱毒甘薯增产潜力的最大发挥。各级繁育供应体系的设置及职责如下图所示。

脱毒甘薯繁育、供应体系示意图