脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程
Rules for virus detection of virus-free see d (s eedling)s weetp otatoes
2000一09一22发布2000一12一01实施
中华人民共和国农业部发布 NY/T 402-2000
前言
为 了有 效 地实施对脱毒甘薯种薯(苗)质量检验和管理，规范脱毒甘薯种薯(苗)市场，促进甘薯脱毒
技术推广，实现脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测的规范化、标准化，特制定本规程。本规程在参照国内外甘薯
病毒检测技术最新研究进展的基础上，结合当前国内生产实际，力求达到快速、准确、可操作性强的检测
要求。检测对象主要选择生产上发生分布范围广、危害性大的病毒。检测方法主要采用指示植物检测和
斑点酶联免疫吸附检测方法。
本 规 程 内容包括脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测的适用范围、检测对象、抽样方法、检测方法和质量
要求。
本 标 准 的附录A、附录B都是标准的附录。
本 标 准 由中华人民共和国农业部提出。
本 标 准 主要起草单位:农业部植物脱毒种苗质量监督检验测试中心(济南)、山东省植物保护总站。
本 标 准 主要起草人:孙作文、商明清、李明立、刘敬东、杨勤民、任宝珍。
中华人民共和国农业行业标准
脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程
NY/T 402-2000
Rules for virus detection of virus-free
se ed ( seedling)s weetp otatoes
1 范围
本 标准 规 定了脱毒甘薯种薯(苗)的病毒检测方法和操作规程。
本 标准 适 用于脱毒甘薯种薯(苗)的病毒检测。
2 定义
本 标 准 采用下列定义。
2.1 脱毒苗
应用 茎 尖 组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘落潜
隐病毒(SPLV)，才确认是脱毒苗。
2.2 脱毒种薯(苗)
从繁 殖 脱 毒苗开始，经逐代繁殖增加种薯(苗)数量的种薯(苗)生产体系生产出来的。分原原种、原
种、生产用种三个级别。
2.2.1 原原种pre-elite
用脱 毒 苗 在防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的种薯(苗)。
2.2.2 原种elite
用 原 原 种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。
2.2.3 生产用种certified seed or seedling
用原 种 作 种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。
2.3 病毒病株允许率
指各 级 甘 薯种薯(苗)繁殖田中病毒病株的允许比率。
3 检测对象
甘薯 羽 状 斑驳病毒(Sweetp otatof eatherym ottlev irus,SPFMV)=
甘薯 潜 隐 病毒(Sweetp otatol atentv irus,SPLV),
4 抽样
41 组培苗抽样
4.1.1 脱毒核心材料:每株必须检测。
4.1.2 扩繁苗:随机抽取l 0 o-2%的扩繁苗检测。
4.2 田间抽样
4.2.1 原原种和原种抽样:定植后30天、60天、收获前2周，在目测全田的基础上，采用五点取样法，
中华人民共和国农业部200。一09.一22批准2000-12一01实施
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NY / T 40 2- 2 00 0
抽样数量为。.1 h m'以下200株;o.11 一 1h m2500株;超出1h m'面积，划出另一检验区，按本规程规定
的面积取样。每株取上、中、下部叶片1-5 g，低温保湿存放，24 h内检测。
4.2.2 生产用种抽样:定植后30天、收获前两周，在目测的基础上，采用随机取样法，0. 1 hm2以下检
验2点，每点100株;0.11^-1 hm，检验五点，每点100株;1.1^-5 hm，检验10点，每点100株;超出
5 hm，面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。取样方法及样品保存同4.2.1,
4.3 商品种薯(苗)抽样
没有 经 过 田间检验的种薯(苗)必须进行块根或种苗检验。
4.3.1 根据甘薯种薯(苗)不同存放方式，采用分层设点取样或随机取样，抽样数量见表1,
表 1 抽 样 数 量 标 准 表
种类种薯(苗)总量抽样百分率,% 抽样最低数量
薯苗
c10 000株6--10 100株
>10 000株3. 5
种薯
簇1o ooo kg 6- 10 loo kg
>10 000 kg 3- 5
注不足抽样最低数量的全部作为混合样品。
2 将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取10%的混合样品检测。
5 检测方法
5.1 X点酶联免疫吸附(Dot-ELISA )检测法
用 于 检 测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒，检测方法见附录A,
5.2 指示植物检测法
用 于 辅 助检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒，检测方法见附录B,
检 测 甘 薯病毒的指示植物及症状见表2,
表 2 检 测 甘 薯 病 毒 的 指 示 植 物 及 症 状
病 毒 种 类 } 指示植物}
SPFM V
SPLV
巴西牵牛
巴西牵牛
症状
羽状斑驳
叶脉变黄
6 质t要求
凡斑 点 酶 联免疫吸附检测或指示植物检测呈阳性者为带毒薯(苗)。
原 原 种 :病毒病株允许率是。。
原种 : 病 毒病株允许率-<2.。%。
生产 用 种 :病毒病株允许率(10000
NY/T 402-2000
(标 准 的 附录)
斑点酶联免痊检测法
Al 溶液配制
所 用 化 学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。
Al.1 三经甲基氨基甲烷(TBS)(p H7.5 )
Tr is base 4 .8 4g
氯化 钠 ( NaCI) 58 .4 4 g
叠氮 钠 ( NaN,) 0. 4 0 g
溶于 19 90m L蒸馏水中，用盐酸(37%)调pH至7.5，定容至20 00m L,
A1.2 洗涤缓冲液(TTBS)
1. 0 m L 吐温一20(Tween-20)溶于20 00m LT BS中。
Al. 3 抽提缓冲液
亚硫 酸 钠 (NazSOO0.20 g 溶于TBS中.定容至100m L,
A1.4 封闭缓冲液(现用现配)
脱脂 奶 粉 0.5 0g
粹 通 X -100(TritonX -100) 0.5 m L
T BS 2 5 m L
先将 脱 脂 奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至25m L。加人TritonX -100混合均匀。
Al.5 抗体稀释缓冲液
脱脂 奶 粉 1.00 g
T BS 50 mL
先将 脱 脂 奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至50m L.
Al. 6 底物缓冲液(pH9. 5 )
Tr is base 6 .0 5g
氯化 钠 ( NaCI) 2. 92 g
氯化 镁 ( M9C12·6H20) 0.5 1 g
叠氮 钠 ( NaN,) 0. 05 g
溶于 450 m L蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至9.5，定容至500m L,
Al- 7 硝基蓝四哇盐(NBT)和5-PA-4-X-3-991*磷酸醋(BCIP)储备液
NB T 储 备液:
NB T 0 .0 4 g
70 % N, N一二甲基甲酞胺1.2 m L
混 合 均 匀，4'C避光保存。
BC IP 储 备液:
BC IP 0 .0 2 g
70 % N, N一二甲基甲酞胺l.2 m L
混 合 均 匀，4'C避光保存。
A1. 8 底物溶液(现用现配)
底 物 缓 冲液25m L
NY /T 4 0 2- 2 00 0
NB T 储 备液75p L
BC IP 储 备液75K L
先 将 N BT储备液溶于25m L底物缓冲液中，再逐滴加入BCIP储备液，边加边振摇混匀。
A2 样品制备
将 待测 叶 片用清水清洗千净，从每一样品叶片上各取一直径约1c m圆片，放人样品袋中，加入
3 mL抽提缓冲液充分研磨.4℃静置30^-40 min，取澄清汁液点样。样品为块根时催芽处理后取幼芽、叶
制样。
A3 操作步骤
A3.， 点样:将打好方格的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取
17 ftL上清液滴在膜上方格的正中，干燥15^30 min。同时设阳性、阴性和空白对照，可根据需要设置重
复。
A3.2 封闭:将干燥后的膜浸泡在封闭缓冲液中，室温下摇床振荡(50 r/min)1 h,
A3.3 孵育第一抗体:将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中，室温下摇床振荡(50r /min)
过夜。
A3.4 洗涤:用洗涤缓冲液洗膜3次，每次摇床振荡(100 r/min)3 min.
A3.5 孵育第二抗体:将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下摇床振荡
(50 r/min)1 h,
A3.6 洗涤:洗涤4次，方法同A3.4.
A3.7 显色:将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室温下摇床振荡(50 r/min)孵育30 min.
A3. 8 终止反应:弃去底物溶液并用燕馏水洗膜3次，每次摇床振荡(100 r/min)3 min.
A3.9 阳性判断:晾干后观察颜色反应，出现蓝紫色颜色反应的样品为阳性。
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附 录B
(标 准的附录)
指示植物检测法
B1 录育指示植物
在 防 虫 条件下盆栽巴西牵牛，至1-2片真叶时嫁接。
以待 测 样 品的茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木，在巴西牵牛的茎部(子叶以下)斜切。将待检样品茎蔓
切成3^-5段，每段带有至少一个腋芽，去叶后将底端削成楔型，插入砧木的切口内，用封口膜扎紧，置
26-32℃防虫网室内遮荫保湿2-3夭。每个样品重复3-5次。同时设阳性对照、阴性对照。嫁接10^-
15天后观察记载症状。
B3 阳性判断
根 据 指 示植物症状，确定病毒有无及种类。在所有嫁接的指示植物中只要有一株表现典型症状，该
样品即为阳性。
